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南京肽業(yè)YM說多肽|磷酸化多肽合成——磷酸基團(tuán)的保護(hù)與去保護(hù)，以及對(duì)酸、堿的特殊敏感性處理

南京肽業(yè)YM說多肽

磷酸化多肽合成

磷酸基團(tuán)的保護(hù)與去保護(hù)，以及對(duì)酸、堿的特殊敏感性處理

核心要義

磷酸化多肽的合成是多肽化學(xué)中對(duì)條件控制要求最嚴(yán)苛的領(lǐng)域之一。磷酸基團(tuán)（尤其是Ser/Thr的磷酸酯）同時(shí)面臨酸催化水解和堿催化β-消除的雙重威脅。成功的合成需要精心設(shè)計(jì)保護(hù)基策略，在合成過程中維持磷酸基團(tuán)的完整，并在最終實(shí)現(xiàn)其選擇性脫保護(hù)。

一、 磷酸化氨基酸的化學(xué)脆弱性與副反應(yīng)機(jī)制

1. 雙重不穩(wěn)定性

   • 酸敏感性：磷酸酯鍵在強(qiáng)酸（如TFA、HF）中可發(fā)生水解，回歸游離磷酸。

   • 堿敏感性：在堿性條件下（如哌啶、DBU），磷酸化的Ser/Thr經(jīng)歷E2消除反應(yīng)，磷酸基作為離去基團(tuán)，導(dǎo)致Cβ-H消除，生成脫氫氨基酸衍生物（如脫氫丙氨酸）并釋放磷酸二價(jià)陰離子。此反應(yīng)迅速且不可逆。

2. 空間與電子效應(yīng)

   • 磷酸基團(tuán)的體積和強(qiáng)負(fù)電性可能干擾肽鏈折疊，降低樹脂溶脹和偶聯(lián)效率。

   • 磷酸化氨基酸的α-氫酸性增強(qiáng)，在活化與偶聯(lián)時(shí)消旋風(fēng)險(xiǎn)增加。

二、 磷酸基保護(hù)基的進(jìn)化與選擇邏輯

保護(hù)策略的核心是：引入合適的保護(hù)基，屏蔽磷酸的酸/堿敏感性，使其在合成中惰性，最后在特定條件下溫和脫除。

1. 芐基保護(hù)體系

• 代表單體：Fmoc-Ser/Thr/Tyr(PO(OBzl)?)-OH

• 穩(wěn)定性：

  • 耐堿：二芐基保護(hù)顯著降低磷酸酯的離去能力，在哌啶脫Fmoc時(shí)能有效抑制β-消除。

  • 酸不穩(wěn)定：可用強(qiáng)酸（TFA、HBr/AcOH）或氫解脫除。

• 應(yīng)用：Fmoc-SPPS的主流選擇。需在最終切割中使用強(qiáng)化TFA配方，并添加大量清除劑（如TES、H?O）捕獲芐基正離子，防止烷基化副反應(yīng)。

• 變體：Fmoc-Tyr(PO(OBzl)?)-OH更穩(wěn)定，但芐基脫除需要更強(qiáng)條件（如延長(zhǎng)切割時(shí)間或加入巰基清除劑）。

2. 叔丁基保護(hù)體系

• 代表單體：Boc-Ser/Thr/Tyr(PO(OtBu)?)-OH

• 穩(wěn)定性：

  • 堿不穩(wěn)定：tBu酯在堿性條件下易消除，與Fmoc-SPPS不兼容。

  • 酸敏感：在TFA中可順利脫除。

• 應(yīng)用：主要用于Boc-SPPS，其α-氨基的TFA脫保護(hù)對(duì)磷酸二叔丁酯影響小，最終用HF或TFMSA實(shí)現(xiàn)全局脫保護(hù)。

3. 烯丙基保護(hù)體系

• 代表單體：Fmoc-Ser/Thr/Tyr(PO(OAllyl)?)-OH

• 穩(wěn)定性：

  • 耐堿、耐弱酸：可耐受哌啶和標(biāo)準(zhǔn)TFA切割條件。

  • 正交脫除：在Pd(0)催化下（如Pd(PPh?)?），經(jīng)親核試劑（如嗎啉、N-甲基哌啶）進(jìn)攻，實(shí)現(xiàn)溫和、選擇性脫保護(hù)。

• 應(yīng)用：用于復(fù)雜正交策略?？稍赥FA切割前或后，用Pd(0)脫除磷酸保護(hù)，避免強(qiáng)酸對(duì)磷酸酯的可能損傷。

4. 環(huán)狀保護(hù)策略

• 設(shè)計(jì)原理：將磷酸基與氨基酸側(cè)鏈羥基形成穩(wěn)定的環(huán)狀衍生物（如2-氧代-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷），徹底消除β-消除風(fēng)險(xiǎn)。

• 脫保護(hù)：合成后，在特定條件（如氧化/水解）下開環(huán)，再生磷酸酯。

• 優(yōu)點(diǎn)：合成過程中絕對(duì)穩(wěn)定。

• 缺點(diǎn)：?jiǎn)误w合成復(fù)雜，開環(huán)條件可能苛刻。

三、 固相合成中的實(shí)戰(zhàn)優(yōu)化

策略：采用Fmoc-SPPS與二芐基保護(hù)磷酸化氨基酸

1. 單體預(yù)處理

   • 磷酸化氨基酸吸濕性強(qiáng)，使用前需充分干燥（P?O?真空干燥）。

   • 用無水DMF或NMP新鮮配制高濃度（0.2-0.3 M）溶液，確保偶聯(lián)效率。

2. 偶聯(lián)條件強(qiáng)化

   • 偶聯(lián)劑：首選低消旋風(fēng)險(xiǎn)的組合，如DIC/Oxyma 或 HATU/HOAt/DIEA。

   • 溫度與時(shí)間：室溫下延長(zhǎng)偶聯(lián)時(shí)間（1-2小時(shí)），或采用微波輔助（50°C， 5-10分鐘）提高效率。

   • 雙偶聯(lián)：對(duì)于磷酸化位點(diǎn)之后的氨基酸，建議進(jìn)行雙偶聯(lián)以確保完全延伸。

3. Fmoc脫保護(hù)條件微調(diào)

   • 使用標(biāo)準(zhǔn)20%哌啶/DMF，但時(shí)間控制在2-5分鐘，避免長(zhǎng)時(shí)間堿暴露。

   • 可監(jiān)測(cè)茚三酮或溴酚藍(lán)測(cè)試，確保脫保護(hù)完全但不過度。

4. 全局脫保護(hù)的“雞尾酒療法”

   • 標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)化配方：TFA : H?O : TES : DODT = 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 (v/v)

     
     

     針對(duì)芐基的強(qiáng)化配方（當(dāng)多個(gè)芐基存在時(shí)）：TFA : H?O : TES : m-甲酚 = 88 : 5 : 2 : 5 (v/v)

   • 切割時(shí)間：延長(zhǎng)至3-4小時(shí)，確保芐基完全脫除。

   • 替代方案：若磷酸酪氨酸芐基難以脫除，可加入少量硫基試劑（如DODT）或使用含1%三氟甲磺酸的TFA。

5. 樹脂與連接子的選擇

   • 推薦使用高度溶脹的樹脂（如Polyethylene glycol-based ChemMatrix?），以容納親水性磷酸肽鏈。

   • 連接子應(yīng)考慮最終產(chǎn)物形式：若需C端酰胺，使用Rink Amide樹脂；若需游離酸，使用Wang樹脂。

四、 替代策略：合成后磷酸化

1. 固相磷酸化

   • 先合成含未保護(hù)Ser/Thr/Tyr的肽樹脂，然后在樹脂上用磷酸化試劑（如二芐基N,N-二異丙基亞磷酰胺，隨后氧化）引入磷酸基團(tuán)。

   • 優(yōu)點(diǎn)：避免使用昂貴單體，可靈活選擇磷酸化位點(diǎn)。

   • 缺點(diǎn)：區(qū)域選擇性難以控制，反應(yīng)效率可能不均一，副產(chǎn)物多。

2. 溶液相磷酸化

   • 將全保護(hù)或部分保護(hù)的肽段在溶液中磷酸化。

   • 挑戰(zhàn)：需要羥基具有顯著的反應(yīng)性差異，且磷酸化試劑可能與肽中其他基團(tuán)反應(yīng)。

五、 純化與分析的特殊考量

1. 純化策略

   • 磷酸肽極性大，在反相HPLC上保留弱?？刹捎茫?/span>

     • 離子對(duì)色譜：使用TFA或庚氟丁酸作為離子對(duì)試劑，增加保留。

     • 親水相互作用色譜（HILIC）：作為反相的補(bǔ)充，特別適合高度磷酸化的肽段。

     • 兩步純化：先通過離子交換粗純，再用反相精純。

2. 表征技術(shù)

   • 質(zhì)譜：

     • ESI-MS中觀察[M+nH]??多電荷離子。

     • 在MS/MS中，磷酸酯易發(fā)生中性丟失（-98 Da, H?PO?；或 -80 Da, HPO?），這是磷酸化的特征信號(hào)。

   • 31P NMR：直接確認(rèn)磷酸基的存在，化學(xué)位移（δ）通常在-0.5至3 ppm（磷酸單酯）。

   • 磷酸特異性染色：如聚丙烯酰胺凝膠電泳后用Pro-Q Diamond磷酸熒光染色。

3. 穩(wěn)定性存儲(chǔ)

   • 磷酸肽在溶液中易水解，建議以凍干粉形式-20°C保存。

   • 避免反復(fù)凍融，溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

六、 前沿進(jìn)展與復(fù)雜應(yīng)用

1. 多重磷酸化與動(dòng)態(tài)修飾模擬

   • 合成含相鄰磷酸化位點(diǎn)（如pSer-pSer）的肽段，研究其協(xié)同效應(yīng)。

   • 開發(fā)光敏或條件敏感的保護(hù)基，實(shí)現(xiàn)磷酸化的時(shí)空可控“激活”，模擬動(dòng)態(tài)修飾過程。

2. 磷酸化依賴性相互作用研究

   • 設(shè)計(jì)含磷酸化位點(diǎn)的肽段，用于篩選結(jié)合蛋白（如SH2、14-3-3結(jié)構(gòu)域），或作為抑制劑阻斷病理性的蛋白-蛋白相互作用。

3. 磷酸化糖肽合成

   • 同時(shí)含有磷酸化和糖基化的肽段，代表了極端的合成挑戰(zhàn)，需要多層正交保護(hù)策略。

4. 非天然磷酸類似物

   • 合成膦酸酯（C-P鍵）或氟代磷酸酯（更穩(wěn)定）的肽類似物，作為不可水解的激酶底物或抑制劑。

總結(jié)
磷酸化多肽合成是一場(chǎng)在酸堿條件鋼絲上行走的精密操作。化學(xué)家必須像戰(zhàn)略家一樣，為脆弱的磷酸基團(tuán)選擇合適的“盔甲”（保護(hù)基），規(guī)劃安全的“行軍路線”（合成策略），并準(zhǔn)備溫和的“卸甲儀式”（脫保護(hù)條件）。隨著新型保護(hù)基和生物正交化學(xué)的發(fā)展，這一領(lǐng)域正朝著合成更復(fù)雜、更接近天然動(dòng)態(tài)修飾系統(tǒng)的方向前進(jìn)，為解碼磷酸化密碼提供了不可替代的化學(xué)工具。

南京肽業(yè)YM說多肽|磷酸化多肽合成——磷酸基團(tuán)的保護(hù)與去保護(hù)，以及對(duì)酸、堿的特殊敏感性處理