總機(jī)：025-58361106-801
傳真：025-58361107-806
Email：info@njpeptide.com
地址：南京市化學(xué)工業(yè)園區(qū)方水路158號(hào)三樓
純化策略
無論固相合成多么高效，粗肽產(chǎn)物始終是一個(gè)含有目標(biāo)序列及多種結(jié)構(gòu)相近雜質(zhì)的復(fù)雜混合物。純化，是將化學(xué)合成的勝利轉(zhuǎn)化為合格產(chǎn)品的最后、也往往是決定性的戰(zhàn)役。本文旨在提供一份多肽純化的全景式?jīng)Q策指南，系統(tǒng)比較制備型反相高效液相色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜及逆流色譜等核心技術(shù)的分離原理、適用場(chǎng)景、通量與成本，并勾勒出一條從微克級(jí)分析驗(yàn)證到千克級(jí)工業(yè)化生產(chǎn)的清晰純化路徑。
在選擇純化方法前，必須明確四個(gè)關(guān)鍵參數(shù)：
目標(biāo)純度：研究級(jí)（>90%）、藥物篩選級(jí)（>95%）、臨床前/臨床級(jí)（>98%）。
樣品規(guī)模：毫克級(jí)、克級(jí)、百克/千克級(jí)。
雜質(zhì)性質(zhì)：與目標(biāo)肽在疏水性、電荷、分子大小上的差異。
時(shí)間與成本：包括設(shè)備投入、溶劑消耗、人工和收率損失。
基于對(duì)粗肽的分析型HPLC-MS圖譜的解讀，可以初步判斷主要雜質(zhì)的性質(zhì)，從而選擇最有效的初純和精純方法。
1. 制備型反相高效液相色譜
分離原理：基于目標(biāo)肽與雜質(zhì)在疏水性上的差異。使用C18或C8鍵合硅膠為固定相，以水-乙腈（含0.1% TFA等離子對(duì)試劑）梯度洗脫。
優(yōu)勢(shì)：
高分辨率：是分離刪除肽、修飾肽、疏水性相近雜質(zhì)的黃金標(biāo)準(zhǔn)，可達(dá)單氨基酸差異的分辨率。
適用范圍極廣：適用于絕大多數(shù)多肽。
與MS兼容：流動(dòng)相易于揮發(fā)，便于后續(xù)凍干和質(zhì)譜分析。
局限與挑戰(zhàn)：
溶劑消耗大：尤其在生產(chǎn)規(guī)模。
樣品負(fù)載有限：過載會(huì)導(dǎo)致峰形展寬、分辨率下降。
硅膠穩(wěn)定性：在高pH水溶液中不穩(wěn)定。
成本：制備柱和儀器投資較高。
規(guī)模應(yīng)用：
分析/半制備級(jí)：柱徑4.6-21.2 mm，適用于1-500 mg純化。
生產(chǎn)級(jí)：柱徑可達(dá)100 mm以上，或采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱，用于克至千克級(jí)純化，但溶劑回收系統(tǒng)至關(guān)重要。
2. 離子交換色譜
分離原理：基于目標(biāo)肽與雜質(zhì)在凈電荷上的差異。在特定pH下，利用肽鏈所帶電荷與離子交換劑（陰離子或陽離子）的相互作用不同進(jìn)行分離。
優(yōu)勢(shì)：
高載量：對(duì)水溶性好、帶電荷的肽載樣量遠(yuǎn)高于RP-HPLC。
成本較低：常用緩沖鹽體系，溶劑成本低。
去除特定雜質(zhì)：特別適合去除側(cè)鏈保護(hù)基脫除不完全的帶電雜質(zhì)或與目標(biāo)肽電荷差異明顯的雜質(zhì)。
局限：
分辨率通常低于RP-HPLC。
產(chǎn)物在鹽緩沖液中，需要額外的脫鹽步驟（通常接RP-HPLC或脫鹽柱）。
典型流程：常作為捕獲步驟，從粗肽混合物中富集目標(biāo)肽，脫鹽后進(jìn)入RP-HPLC進(jìn)行精純。
3. 尺寸排阻色譜
分離原理：基于分子流體力學(xué)體積（與分子量相關(guān)）的差異。大分子先流出，小分子后流出。
優(yōu)勢(shì)：
條件溫和：通常在等度緩沖液中進(jìn)行，不涉及有機(jī)溶劑或劇烈的pH變化，有利于保持肽的生物活性。
脫鹽/緩沖液交換：是其經(jīng)典應(yīng)用。
局限：
分辨率最低，無法分離分子量相近的肽（如目標(biāo)肽與缺失一個(gè)氨基酸的雜質(zhì)）。
樣品體積受限，上樣體積通常不超過柱體積的5%。
應(yīng)用場(chǎng)景：主要用于去除二聚體/多聚體，或作為脫鹽/緩沖液交換步驟。
4. 逆流色譜
分離原理：一種無固相支持體的液-液分配色譜。利用目標(biāo)肽在兩種互不相溶的溶劑體系（如正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水）中的分配系數(shù)差異進(jìn)行分離。
優(yōu)勢(shì)：
無不可逆吸附：樣品100%回收，無因吸附導(dǎo)致的損失。
載樣量巨大：適用于克至千克級(jí)的規(guī)模化制備。
溶劑成本可大幅降低：溶劑可回收再利用。
耐用：無昂貴色譜柱損耗。
局限：
方法開發(fā)復(fù)雜：需要尋找合適的兩相溶劑體系。
分辨率通常不及制備HPLC。
儀器相對(duì)小眾。
定位：在需要大規(guī)模、低成本純化，且對(duì)純度的要求（如>95%）可由CCC滿足時(shí)，它是極具競(jìng)爭(zhēng)力的選擇，尤其適用于肽類中間體或API的工業(yè)純化。
以下流程圖展示了如何根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的純度和規(guī)模，選擇最優(yōu)的純化技術(shù)組合路徑：
案例1（10 mg， 研究用）：粗肽雜質(zhì)以缺失肽為主，疏水性差異明顯。直接使用半制備C18柱，用水/乙腈/TFA梯度洗脫，一次運(yùn)行即可獲得>95%純度的產(chǎn)物。
案例2（5 g， 臨床前研究）：粗肽中含有大量帶電副產(chǎn)物（如帶部分保護(hù)基的肽）。采用 “強(qiáng)陽離子交換捕獲 → 脫鹽柱 → 制備RP-HPLC精制” 的組合策略。IEC步驟去除了大量雜質(zhì)，保護(hù)了昂貴的RP-HPLC柱，并提高了總載樣量。
案例3（100 g， 工藝開發(fā)）：目標(biāo)純度要求>97%，但對(duì)生產(chǎn)成本有嚴(yán)格限制。經(jīng)篩選，目標(biāo)肽在乙酸乙酯/乙醇/水體系中具有合適的分配系數(shù)。采用逆流色譜進(jìn)行主體純化，將主要雜質(zhì)去除后，產(chǎn)物純度達(dá)96%，再經(jīng)過一次小規(guī)模的制備RP-HPLC精制，最終獲得符合要求的100g產(chǎn)品，總?cè)軇┏杀颈热淌褂蒙a(chǎn)型HPLC降低約60%。
分析柱篩選：在分析型HPLC上，使用不同色譜柱（C18, C8, 苯基柱）和不同pH的流動(dòng)相，尋找能最大化目標(biāo)峰與最近雜質(zhì)峰分離度的條件。
載樣量測(cè)試：在制備柱上，從小載樣量開始逐步增加，觀察峰形和分辨率的保持情況，確定最大上樣量。
收率與純度平衡：通過調(diào)整收集餾分的切割點(diǎn)，在純度和收率之間找到最佳平衡。通常舍棄峰前沿和拖尾部分。
在線檢測(cè)：使用紫外檢測(cè)器（214 nm用于肽鍵， 280 nm用于芳香族氨基酸）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)流出液，指導(dǎo)餾分收集。
產(chǎn)物驗(yàn)證：合并目標(biāo)餾分后，必須進(jìn)行分析型HPLC-MS和旋光檢測(cè)，確認(rèn)純度和結(jié)構(gòu)。
連續(xù)多柱層析：模擬移動(dòng)床技術(shù)，可大幅提高生產(chǎn)率和溶劑利用率，是大型生物藥生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，正在向合成多肽領(lǐng)域滲透。
純化-凍干一體化系統(tǒng)：提高自動(dòng)化程度，減少中間操作和污染風(fēng)險(xiǎn)。
多肽純化是一門結(jié)合了分析化學(xué)、化工分離與經(jīng)濟(jì)學(xué)的綜合藝術(shù)。沒有一種技術(shù)是萬能的，其選擇與組合高度依賴于具體的產(chǎn)品需求與生產(chǎn)語境。從高分辨但高成本的制備HPLC，到高載量且成本效益突出的逆流色譜，每一種工具都在純化武器庫中占據(jù)獨(dú)特位置。掌握從分析到制備、從毫克到千克的全尺度純化邏輯，意味著能夠?yàn)槿魏坞A段、任何用途的多肽項(xiàng)目，設(shè)計(jì)和執(zhí)行一條最優(yōu)的“從粗品到純品”的轉(zhuǎn)化路徑，最終確保合成工作的價(jià)值在純凈的產(chǎn)物中得到完美體現(xiàn)。
南京肽業(yè)YM說多肽|純化策略：從制備型HPLC到逆流色譜，不同純度與規(guī)模需求下的純化路徑選擇
南京肽業(yè)生物科技有限公司
地址：
江蘇省南京市化學(xué)工業(yè)園區(qū)方水路158號(hào)三樓
Email: info@njpeptide.com
總機(jī)：025-58361106-801
傳真：025-58361107-806
