學(xué)術(shù)動(dòng)態(tài)
以賴氨酸、糖等為砌塊構(gòu)建新型陽(yáng)離子大分子及其應(yīng)用研究
孫景景
中國(guó)科學(xué)院大學(xué)
摘要：本論文主要以賴氨酸、聚乳酸、半乳糖等天然產(chǎn)物為砌塊，設(shè)計(jì)、合成了系列新型結(jié)構(gòu)規(guī)整的陽(yáng)離子功能大分子，研究了其作為基因輸送載體的應(yīng)用，進(jìn)而探索載體大分子結(jié)構(gòu)與組成對(duì)其基因輸送性能及相關(guān)細(xì)胞輸送機(jī)制的影響規(guī)律。與此同時(shí)，采用pH和還原響應(yīng)性砌塊，設(shè)計(jì)制備了具有雙重環(huán)境響應(yīng)性的殼交聯(lián)大分子膠束，研究了其在水溶液中的環(huán)境響應(yīng)性質(zhì)及其作為智能藥物輸送載體的應(yīng)用。具體研究?jī)?nèi)容主要包括以下五個(gè)部分: 一、含賴氨酸的甲基丙烯酸酯類陽(yáng)離子大分子PHML的合成、表征以及RAFT聚合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究 以天然賴氨酸為功能砌塊，設(shè)計(jì)合成制備了含Boc-賴氨酸的甲基丙烯酸酯類單體HEMA-Boc-Lys，進(jìn)一步采用RAFT聚合法，活性聚合制備得到系列分子量的PHML-Boc大分子，并考察了其RAFT聚合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)脫除Boc保護(hù)基，制備得到新型水溶性陽(yáng)離子大分子PHML，并運(yùn)用1H NMR、GPC和FT-IR等手段對(duì)其大分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。研究結(jié)果表明制備所得的PHML系列大分子(6K、10K、15K、23K和30K)結(jié)構(gòu)規(guī)整，且分子量易調(diào)控，為進(jìn)一步深入研究PHML大分子結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系提供了基礎(chǔ)?！ 《?、新型陽(yáng)離子功能大分子PHML作為基因載體的應(yīng)用及相關(guān)細(xì)胞內(nèi)輸送機(jī)制的研究 以上述制備所得陽(yáng)離子大分子PHML為非病毒基因載體，運(yùn)用酸堿滴定、瓊脂糖凝膠電泳、動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、透射電子顯微鏡(TEM)等分析表征手段，研究了PHML的溶液質(zhì)子緩沖能力、pDNA結(jié)合力以及PHML/pDNA復(fù)合物的尺度、表面電勢(shì)和形貌。分別采用CCK-8和乳酸脫氫酶(LDH)評(píng)價(jià)方法，研究了PHML載體的體外細(xì)胞毒性和細(xì)胞膜破壞力。進(jìn)一步采用熒光素酶(luciferase)編碼基因、綠色熒光蛋白(GFP)編碼基因和p53基因?yàn)閳?bào)告基因，研究了PHML載體/pDNA復(fù)合物在多種細(xì)胞系中的基因轉(zhuǎn)染行為。并運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞內(nèi)吞途徑選擇性抑制和細(xì)胞內(nèi)熒光共定位等方法研究了PHML/pDNA復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞效率、內(nèi)吞途徑及胞內(nèi)輸送機(jī)制。研究結(jié)果表明，隨著分子量的增加，PHML載體的pDNA結(jié)合力、基因轉(zhuǎn)染效率以及相關(guān)pDNA復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞效率趨于增強(qiáng)。與商業(yè)化線性聚賴氨酸PLL(15-30K)載體相比，PHML-30K載體呈現(xiàn)更低的細(xì)胞毒性、更佳的基因轉(zhuǎn)染效率和更高的復(fù)合物細(xì)胞內(nèi)吞效率。此外，通過(guò)調(diào)節(jié)PHML載體的分子量可調(diào)控其pDNA復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞途徑，PHML-30K/pDNA復(fù)合物主要通過(guò)陷穴小泡(caveolae)介導(dǎo)的內(nèi)吞和微管途徑遷移進(jìn)入細(xì)胞，并且具有內(nèi)涵體逃逸及釋放的pDNA繞核分布現(xiàn)象?！ ∪?、生物可降解三嵌段共聚大分子PHML-b-PLLA-b-PHML的合成、自組裝及其作為基因輸送載體的應(yīng)用研究 采用開(kāi)環(huán)聚合(ROP)和原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)方法合成制備了系列結(jié)構(gòu)規(guī)整的生物可降解三嵌段共聚大分子PHMLn-b-PLLA22-b-PHMLn(n=17，24，30)，并進(jìn)一步將其溶于水，制備了兩親嵌段大分子膠束PHML-b-PLLA-b-PHMLNP。運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳和脫氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)酶解法研究了PHML-b-PLLA-b-PHML NP的pDNA結(jié)合力及其pDNA復(fù)合物的抗酶解穩(wěn)定性。進(jìn)一步運(yùn)用DLS和原子力顯微鏡(AFM)研究了陽(yáng)離子大分子膠束PHML-b-PLLA-b-PHML NP及其pDNA復(fù)合物的尺寸、表面電勢(shì)及形貌。在此基礎(chǔ)上，以PHML-b-PLLA-b-PHML NP為基因載體，研究了其H1299細(xì)胞毒性、基因轉(zhuǎn)染及相關(guān)復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞途徑。研究結(jié)果表明，PHML-b-PLLA-b-PHMLNP具有較低的細(xì)胞毒性和較高的pDNA結(jié)合力，并能夠有效地保護(hù)pDNA避免被核酸酶降解。在10％FBS的存在下，PHML-b-PLLA-b-PHML NP載體呈現(xiàn)接近于bPEI-25K對(duì)比參照的基因轉(zhuǎn)染效率。此外，PHML30-b-PLLA22-b-PHML30NP載體負(fù)載pDNA通過(guò)脂筏途徑內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，與病毒載體的細(xì)胞內(nèi)吞途徑具有相似性?！ ∷?、具有側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的新型陽(yáng)離子大分子的制各及其作為基因輸送載體的研究 采用RAFT聚合法合成制備了系列結(jié)構(gòu)規(guī)整的具有側(cè)掛天然賴氨酸和半乳糖的陽(yáng)離子大分子PHML-b-PMAGal和P(HML-st-MAGal)。運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳、DLS、TEM等分析表征方法，研究了系列陽(yáng)離子大分子的pDNA結(jié)合力及其pDNA復(fù)合物的尺寸、表面電勢(shì)和形貌。以系列陽(yáng)離子大分子為基因載體，運(yùn)用MTT法和熒光素酶法研究了其細(xì)胞毒性和基因轉(zhuǎn)染行為。結(jié)果表明，PHML-b-PMAGal和P(HML-st-MAGal)大分子載體的細(xì)胞毒性和基因轉(zhuǎn)染效率與其大分子的共聚單元序列結(jié)構(gòu)和半乳糖的含量密切相關(guān)。在系列所得大分子載體中，半乳糖含量為4.8％的P(HML40-st-MAGal4)載體在10％ FBS存在下，H1299細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染效率最優(yōu)，且在多種細(xì)胞系中均呈現(xiàn)高于bPEI-25K載體參照的基因轉(zhuǎn)染效率?！ ∵M(jìn)一步以實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)最優(yōu)基因轉(zhuǎn)染的P(HML40-st-MAGal4)載體為研究對(duì)象，采用流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞內(nèi)吞途徑選擇性抑制和熒光共定位方法，研究了載體/pDNA復(fù)合物在10％FBS下的細(xì)胞內(nèi)吞效率、內(nèi)吞途徑及胞內(nèi)輸送機(jī)制。研究結(jié)果表明10％FBS的存在沒(méi)有改變P(HML40-st-MAGal4)/pDNA復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞途徑，但改變了復(fù)合物經(jīng)由不同內(nèi)吞途徑被細(xì)胞所攝取的比例，這可能是其在10％FBS下細(xì)胞內(nèi)吞效率和基因轉(zhuǎn)染效率增加的原因。此外，P(HML40-st-MAGal4)/p DNA復(fù)合物在10％FBS下仍具有較強(qiáng)的內(nèi)涵體逃逸能力，且逃逸的pDNA能夠快速遷移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。 五、雙重環(huán)境響應(yīng)性殼交聯(lián)大分子膠束的制備及其作為藥物輸送載體的研究 采用RAFT聚合法合成制備了系列結(jié)構(gòu)規(guī)整的兩嵌段三組分共聚大分子PDPA-b-P(NMS-co-OEG)，并運(yùn)用溶液自組裝法制備了尺寸為30～90 nm的大分子膠束。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用胱胺交聯(lián)劑，制備了P DPA-b-P(NMS-co-OEG)殼交聯(lián)大分子膠束，并運(yùn)用DLS、TEM、1H NMR、熒光光譜法研究了殼交聯(lián)大分子膠束的尺寸、形貌及環(huán)境響應(yīng)性質(zhì)。結(jié)果表明PDPA33-b-P(NMS22-co-OEG25)殼交聯(lián)大分子膠束具有pH和還原雙重環(huán)境響應(yīng)性，在酸性條件下疏水內(nèi)核發(fā)生溶脹，在10 mM GSH的存在下交聯(lián)殼層發(fā)生反應(yīng)解交聯(lián)，當(dāng)同時(shí)在酸性條件和10 mM GSH的存在下時(shí)，大分子膠束發(fā)生解離轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂??！ ∵M(jìn)一步以喜樹堿(CPT)為疏水藥物模型，研究了PDPA33-b-P(NMS22-co-OEG25)未交聯(lián)和殼交聯(lián)大分子膠束對(duì)藥物的負(fù)載能力及載藥膠束的CPT體外釋放行為，并考察了其作為藥物載體的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，PDPA33-b-P(NM S22-co-OEG25)未交聯(lián)及殼交聯(lián)大分子膠束對(duì)H1299細(xì)胞無(wú)明顯毒性。通過(guò)殼交聯(lián)，大分子膠束的載藥量和包封率顯著增加，在pH=7.4下的CPT釋放速度顯著降低。此外，酸性或/和還原性環(huán)境均能夠單獨(dú)或協(xié)同促進(jìn)PDPA33-b-P(NMS22-co-OEG25)殼交聯(lián)載藥大分子膠束的CPT釋放。
關(guān)鍵詞：陽(yáng)離子 大分子 賴氨酸 聚乳酸 半乳糖 合成工藝 基因輸送性能
授予學(xué)位：博士
學(xué)科專業(yè)：高分子化學(xué)與物理
導(dǎo)師姓名：曹阿民
學(xué)位年度：2014
語(yǔ)種：中文
分類號(hào)：TQ460.6(制藥化學(xué)工業(yè))
以賴氨酸、糖等為砌塊構(gòu)建新型陽(yáng)離子大分子及其應(yīng)用研究|孫景景|中國(guó)科學(xué)院大學(xué)
陽(yáng)離子|大分子|賴氨酸|聚乳酸|半乳糖|合成工藝|基因輸送性能
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專業(yè)名稱縮寫一覽表
第一章 前言
第一節(jié) 研究背景
第二節(jié) 本論文的工作設(shè)想
參考文獻(xiàn)
第二章 含賴氨酸的甲基丙烯酸酯類陽(yáng)離子大分子PHML的合成、結(jié)構(gòu)表征以及RAFT聚合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究
第一節(jié) 引言
第二節(jié) 含賴氨酸的甲基丙烯酸酯功能單體及RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑的合成與結(jié)構(gòu)表征
第三節(jié) 含賴氨酸的甲基丙烯酸酯單體的RAFT聚合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究
第四節(jié) RAFT聚合制備含賴氨酸側(cè)基的陽(yáng)離子功能大分子及其結(jié)構(gòu)表征
本章小結(jié)
實(shí)驗(yàn)部分
參考文獻(xiàn)
第三章 新型陽(yáng)離子功能大分子PHML作為基因載體的應(yīng)用及細(xì)胞內(nèi)輸送機(jī)制的研究
第一節(jié) 引言
第二節(jié) 陽(yáng)離子大分子PHML的質(zhì)子緩沖性能和pDNA結(jié)合力研究
第三節(jié) 陽(yáng)離子大分子PHML／pDNA復(fù)合物的表征研究
第四節(jié) 陽(yáng)離子大分子PHML的HeLa細(xì)胞毒性及其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染研究
第五節(jié) PHML陽(yáng)離子大分子載體在其它細(xì)胞系的基因轉(zhuǎn)染研究
第六節(jié) 陽(yáng)離子大分子PHML／pDNA復(fù)合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究
本章小結(jié)
實(shí)驗(yàn)部分
參考文獻(xiàn)
第四章 生物可降解三嵌段共聚大分子PHML-b-PLLA-b-PHML的合成、自組裝及其作為基因輸送載體的研究
第一節(jié) 引言
第二節(jié) PHML-b-PLLA-b-PHML三嵌段共聚大分子的合成與結(jié)構(gòu)表征
第三節(jié) 兩親三嵌段共聚大分子PHML-b-PLLA-b-PHML自組裝膠束的研究
第四節(jié) PHML-b-PLLA-b-PHML NP／pDNA復(fù)合物的表征研究
第五節(jié) PHML-b-PLLA-b-PHML大分子及PHML-b-PLLA-b-PHML NP／pDNA復(fù)合物的細(xì)胞毒性研究
第六節(jié) PHML-b-PLLA-b-PHML NP／pDNA復(fù)合物的H1299細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染及內(nèi)吞機(jī)制研究
本章小結(jié)
實(shí)驗(yàn)部分
參考文獻(xiàn)
第五章 側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的新型陽(yáng)離子大分子的制備及其作為基因輸送載體的研究
第一節(jié) 引言
第二節(jié) 側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的陽(yáng)離子大分子的合成與結(jié)構(gòu)表征
第三節(jié) 側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的新型陽(yáng)離子大分子／pDNA復(fù)合物的表征研究
第四節(jié) 側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的新型陽(yáng)離子大分子作多基因輸送載體的研究
第五節(jié) 含半乳糖陽(yáng)離子大分子P(HML40-st-MAGal4)／pDNA復(fù)合物的細(xì)胞輸運(yùn)機(jī)制的研究
本章小結(jié)
實(shí)驗(yàn)部分
參考文獻(xiàn)
第六章 雙重響應(yīng)性殼交聯(lián)膠束的制備及其作為藥物輸送載體的應(yīng)用研究
第一節(jié) 引言
第二節(jié) PDPA-b-P(NMS-co-OEG)共聚大分子的合成與結(jié)構(gòu)表征
第三節(jié) PDPA-b-P(NMS-co-OEG)大分子自組裝膠束及殼交聯(lián)膠束的制備與表征
第四節(jié) PDPA-b-P(NMS-co-OEG)大分子膠束及殼交聯(lián)膠束的環(huán)境響應(yīng)性研究
第五節(jié) PDPA-b-P(NMS-co-OEG)溶液自組裝大分子膠束及其殼交聯(lián)膠束作為藥物輸送載體的研究
本章小結(jié)
實(shí)驗(yàn)部分
參考文獻(xiàn)
全文總結(jié)與展望
全文總結(jié)
今后進(jìn)一步工作的展望
附錄
作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
以賴氨酸、糖等為砌塊構(gòu)建新型陽(yáng)離子大分子及其應(yīng)用研究|孫景景|中國(guó)科學(xué)院大學(xué)
陽(yáng)離子|大分子|賴氨酸|聚乳酸|半乳糖|合成工藝|基因輸送性能
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