含酪氨酸硫酸化修飾的芋螺毒素的高效合成方法及表征

李長鵬

華南理工大學(xué)

DOI：   10.27151/d.cnki.ghnlu.2020.004589

摘要：蛋白質(zhì)酪氨酸硫酸化(Sulfotyrosine,sY)是一種普遍存在于生物體內(nèi)的翻譯后修飾。多數(shù)硫酸化蛋白質(zhì)會參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interaction,PPI)從而影響生理功能如止血、白細胞黏附等,其中有部分PPI過程是通過識別酪氨酸上的硫酸根來參與,因此,sY與蛋白生物活性的關(guān)系備受關(guān)注。當前較普遍采用的策略是通過新戊基(Neopentyl,nP)來對硫酸根進行保護從而防止其在多肽合成中水解,但目前合成的多數(shù)硫酸化多肽其序列不含半胱氨酸(Cys)殘基,這與其側(cè)鏈巰基在nP脫除條件下不穩(wěn)定有關(guān)。然而,Cys存在于多數(shù)重要生理蛋白/多肽中,因此有必要開發(fā)一種更為普適的、含半胱氨酸的硫酸化修飾多肽合成方法來推動相關(guān)多肽/蛋白藥物的基礎(chǔ)研究。芋螺毒素被譽為“海洋藥物寶庫”,其藥用活性已經(jīng)成為當今國際生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點之一。α4/7-芋螺毒素一般由15-22個氨基酸組成且包含4個Cys,因其能特異性阻斷神經(jīng)型乙酰膽堿受體而被認為是極具潛力的神經(jīng)性疾病藥物。此前有研究人員通過質(zhì)譜手段發(fā)現(xiàn)部分α4/7-芋螺毒素存在sY修飾,但由于難以獲取均一硫酸化多肽而導(dǎo)致其活性及相關(guān)研究并未能順利開展。在本論文工作中,我們對sY的保護基nP的脫除方法進行了一系列探索,最終得到了其保護基脫除的一般性規(guī)律,認為nP在大多數(shù)水溶液中均可脫除。我們將該方法應(yīng)用于8條硫酸化α4/7-芋螺毒素的合成:通過Fmoc-SPPS策略制備得到線性多肽,以分步、選擇性的方法對多肽進行定向折疊,在折疊的同時完成nP基團的脫除,實現(xiàn)一鍋法高效制備含sY的目標多肽。并且,我們也成功避免了硫酸根在酸性條件下的水解問題,最終利用常規(guī)HPLC制備得到含sY修飾的芋螺毒素。通過動物血清實驗表明了多肽在血清中具有良好的穩(wěn)定性且sY修飾不會降低多肽的穩(wěn)定性。最后,為了探究sY修飾對于芋螺毒素與乙酰膽堿結(jié)合蛋白相互作用的影響,我們對乙酰膽堿結(jié)合蛋白的重組表達進行了初試,但發(fā)現(xiàn)該蛋白在透析復(fù)性以及蛋白酶切過程中極易多聚且不可控?？偟膩碚f,我們開發(fā)了一種高效的含半胱氨酸的硫酸化多肽的合成方法來推動硫酸化多肽/蛋白的合成研究,并為硫酸化修飾多肽/蛋白的藥用機理研究打下堅實的基礎(chǔ)。 

關(guān)鍵詞：      酪氨酸硫酸化修飾;多肽合成;多肽折疊;新戊基的脫除;芋螺毒素;乙酰膽堿結(jié)合蛋白;

專輯：   工程科技Ⅰ輯

專題：   有機化工

DOI：   10.27151/d.cnki.ghnlu.2020.004589

分類號：      TQ464

導(dǎo)師：   何春茂;

學(xué)科專業(yè)：   分析化學(xué)

碩士電子期刊出版信息： 年期：2021年第02期網(wǎng)絡(luò)出版時間：2021-01-16——2021-02-15

 含酪氨酸硫酸化修飾的芋螺毒素的高效合成方法及表征|李長鵬|華南理工大學(xué)

 酪氨酸硫酸化修飾|多肽合成|多肽折疊|新戊基的脫除|芋螺毒素|乙酰膽堿結(jié)合蛋白

 

文章目錄
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 引言
    1.2 芋螺毒素
        1.2.1 芋螺毒素的折疊研究
        1.2.2 芋螺毒素類似物和突變體研究
        1.2.3 α4/7-芋螺毒素與硫酸化酪氨酸
    1.3 乙酰膽堿結(jié)合蛋白
    1.4 酪氨酸硫酸化(sY)修飾
        1.4.1 酪氨酸硫酸化修飾的生理學(xué)作用
        1.4.2 酪氨酸硫酸化修飾的檢測和預(yù)測
        1.4.3 含硫酸化的蛋白質(zhì)/多肽的制備方法
    1.5 固相多肽合成(SPPS)
        1.5.1 SPPS策略
        1.5.2 SPPS試劑以及純化方法的選擇
    1.6 本文的研究內(nèi)容與研究意義
        1.6.1 研究內(nèi)容
        1.6.2 研究意義
第二章 Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH的合成以及脫保護
    2.1 引言
    2.2 實驗部分
        2.2.1 實驗原料
        2.2.2 實驗儀器
        2.2.3 Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH的合成
        2.2.4 nP保護基脫除條件篩選
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH合成表征
        2.3.2 保護基脫除結(jié)果
    2.4 本章小結(jié)
第三章 α4/7-芋螺毒素的化學(xué)合成
    3.1 引言
    3.2 實驗部分
        3.2.1 實驗原料
        3.2.2 實驗儀器
        3.2.3 不含sY芋螺毒素的合成以及折疊
        3.2.4 含sY芋螺毒素的合成以及折疊
        3.2.5 血清穩(wěn)定性實驗
        3.2.6 多肽分離和富集純化
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 合成方法的探究
        3.3.2 α4/7-芋螺毒素的合成與折疊
        3.3.3 圓二色光譜
        3.3.4 芋螺毒素血清穩(wěn)定性
    3.4 本章小結(jié)
第四章 乙酰膽堿結(jié)合蛋白表達方法的探究
    4.1 引言
    4.2 實驗部分
        4.2.1 實驗原料
        4.2.2 實驗儀器
        4.2.3 His6-SUMO-Ac-ACh BP的包涵體表達
        4.2.4 蛋白質(zhì)復(fù)性和酶切條件的探究
        4.2.5 蛋白質(zhì)分析與純化方法
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達條件篩選
        4.3.2 復(fù)性,酶切以及純化
    4.4 本章小結(jié)
結(jié)論與展望
參考文獻
攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
附件

含酪氨酸硫酸化修飾的芋螺毒素的高效合成方法及表征|李長鵬|華南理工大學(xué)

 酪氨酸硫酸化修飾|多肽合成|多肽折疊|新戊基的脫除|芋螺毒素|乙酰膽堿結(jié)合蛋白