3CLPro是冠狀病毒復(fù)制所必須的酶 可作為有效的抗病毒藥物靶點(diǎn)
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3CLPro是冠狀病毒復(fù)制所必須的酶，可作為有效的抗病毒藥物靶點(diǎn)，2003年SARS以來已經(jīng)有大量的研究基礎(chǔ)。Lopinavir與Ritonavir等抗HIV藥物也是作用于類似的蛋白酶靶點(diǎn)，并在臨床上得到很好的驗(yàn)證。由于人體內(nèi)沒有與3CLPro類似切割位點(diǎn)的蛋白酶，可篩選出高特異性的抑制劑，具有更好的安全性。3CLPro在beta冠狀病毒中保守性高，篩選出的3CLPro抑制劑具有廣譜抗冠狀病毒能力，甚至可能用于豬冠狀病毒等其他動(dòng)物的疾病治療中。
3CLPro是冠狀病毒復(fù)制所必須的酶 可作為有效的抗病毒藥物靶點(diǎn)
3CLPro是新型冠狀病毒（2019-nCoV, SARS-CoV-2）產(chǎn)生的主要的蛋白酶，冠狀病毒大多數(shù)功能蛋白（非結(jié)構(gòu)蛋白）由ORF1ab基因編碼，先翻譯成一個(gè)多蛋白體（7096aa），再由3CLPro切割成多個(gè)有活性的蛋白如病毒復(fù)制蛋白R(shí)dRp。此外，該蛋白可能切割胞內(nèi)蛋白NEMO從而抑制干擾素信號(hào)途徑的活化。因此抑制3CLPro能夠有效抑制病毒的感染與復(fù)制。▲3CLPro在ORF1ab編碼的多蛋白體上有11個(gè)切點(diǎn)(Thanigaimalai Pillaiyar)2019-nCoV與SARS-CoV的3CLPro只差12個(gè)氨基酸，同源性大于96%，兩者結(jié)構(gòu)基本一致（見下圖）。3CLPro 識(shí)別位點(diǎn)依賴于P1位的Gln。迄今為止沒有發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)識(shí)別Gln的蛋白酶，研究者推測(cè)該酶的抑制劑可能有更好的安全性。
▲3CLPro蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(Linlin Zhang)
這次疫情中使用的抗HIV藥物洛匹那韋（lopinavir）和利托那韋（ritonavir）最早設(shè)計(jì)用來抑制HIV蛋白酶。2003年SARS期間United Christian醫(yī)院C M Chu等用于41例SARS治療，患者死亡率只有2.4%。比較此前的常規(guī)治療過111個(gè)非典患者死亡率為28.8%有明顯的治療效果。后來SARS結(jié)束，研究沒能繼續(xù)下去。由于新冠病毒3CLPro與SARS-CoV高度同源，這次疫情中這兩種抑制劑被寄予厚望，迅速成為網(wǎng)紅。表一：在中國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)注冊(cè)中心注冊(cè)的洛匹那韋（lopinavir）和利托那韋（ritonavir）臨床研究值得注意的是，雖然Lopinavir與Ritonavir最早在SARS和MERS治療中表現(xiàn)出一定的有效性，在新冠肺炎治療上的有效性仍需謹(jǐn)慎樂觀。HIV蛋白酶屬于天冬氨酸蛋白酶家族，而冠狀病毒蛋白酶為絲氨酸蛋白酶家族，且HIV蛋白酶抑制劑專門針對(duì)HIV蛋白酶二聚體口袋優(yōu)化（見下圖左），這個(gè)口袋在冠狀病毒蛋白酶中并不存在，Nukoolkarn等人通過軟對(duì)接分析認(rèn)為兩個(gè)小分子結(jié)合到3CLPpro底物結(jié)合位點(diǎn)（下圖右紅色圓圈，筆者沒查到實(shí)驗(yàn)證據(jù)，如有歡迎留言）。該藥物對(duì)HIV蛋白酶的抑制活性為1.3 pM(Ki)，對(duì)3CLPro抑制活性為15uM(Ki)，體外對(duì)SARS病毒的活性濃度分別為4ug/ml和50ug/ml。
由于這次病毒潛伏期長(zhǎng)，傳染源不明確，專家預(yù)測(cè)新型冠狀病毒可能像流感一樣長(zhǎng)期與人類共存。2003年以來，研究者針對(duì)SARS-CoV、MERS-CoV和這次的2019-nCoV 3CLPro抑制劑做了大量研究工作，在這些工作的基礎(chǔ)上尋找更有效的新冠治療藥物不僅僅是當(dāng)務(wù)之急，也是應(yīng)對(duì)人類可能面對(duì)的未來風(fēng)險(xiǎn)的必須努力。表二：在clinical trials上注冊(cè)的3CLPro其他抑制劑臨床研究疫情以來，基于3CLPro結(jié)構(gòu)有多篇文章通過計(jì)算機(jī)模擬虛擬篩選了可能用于新冠肺炎治療的藥物，除上述Lopinavir與Ritonavir外，Kwok-Yin Wong等人通過結(jié)構(gòu)模擬從已經(jīng)上市的藥物中篩選了16個(gè)潛在的抗2019-nCoV藥物，其中NS5A抑制劑ledipasvir（雷地帕韋） 和velpatasvir（維帕他韋）副作用小，Epclusa (velpatasvir / sofosbuvir（索氟布韋）) and Harvoni (ledipasvir / sofosbuvir)也許有更好的抑制效果。Chen Lingling等人基于3CLPro篩選了32297種潛在的抗病毒藥用植物化合物并發(fā)現(xiàn)9種可能優(yōu)化后用于抗COVID-19的治療效果。Alessandro Contini從3118個(gè)FDA已經(jīng)批準(zhǔn)上市的藥物中通過虛擬篩選，鑒定出Indinavir、Lopinavir and Atazanavir及Cobicistat（原靶點(diǎn): CYP3A）等多個(gè)潛在的藥物。Arun K. Shanker研究了Aza-Peptide Epoxide (APE)作為起始結(jié)構(gòu)的可能。Jared S.Morse等人提示化合物3CLPro-1可以在nM水平上抑制SARS和MERS 病毒3CLPro活性，可能對(duì)2019-nCoV 3CLPro有效。Zhijian Xu等認(rèn)為奈非那韋Nelfinavir可能跟3CLPro結(jié)合。
▲Jared S.Morse推薦的針對(duì)SARS-CoV 3CLPro抑制劑。
A-C: Lead vinylsulfone protease inhibitors; D: 已有人體數(shù)據(jù)的3CLPro-1; E-F:在FIPV上驗(yàn)證的3CLPro抑制劑，GC376對(duì)SARS-CoV 3CLPro IC50=4.35uM, CC50>150uM, 有很好的安全性。
▲可能抑制3CLPro的幾種已上市藥物計(jì)算機(jī)模擬篩選結(jié)果（Kwok-Yin Wong）
過去二十年中，人類遭遇三次beta冠狀病毒的襲擊，雖然SARS-CoV神秘的消失了，基于COVID-19全球蔓延的趨勢(shì)，而MERS病毒至今沒有被控制，開發(fā)一種廣譜的抗冠狀病毒藥物成為關(guān)系到人類安全的重要任務(wù)。由于3CLPro在SARS、MERS病毒和2019-nCoV中高度保守，人類在HIV蛋白酶抑制劑上的成功經(jīng)驗(yàn)，3CLPro是廣譜抗冠狀病毒藥物的有效靶點(diǎn)。
有趣的是，雖然3CLPro與HIV蛋白酶結(jié)構(gòu)差異非常大，計(jì)算機(jī)模擬篩選的很多藥物為HIV蛋白酶抑制劑。基于純化的3CLPro蛋白的酶活性驗(yàn)證和結(jié)構(gòu)驗(yàn)證是2019-nCoV蛋白酶抑制劑篩選的重要手段。此外，3CLPro通過切割Dabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans檢測(cè)靈敏度高，很容易建立高通量篩選體系。
▲Zhang Linlin等人報(bào)導(dǎo)的α-酮酰胺類3CLPro抑制劑。針對(duì)2019-nCoV的化合物11b抑制3CLPro IC50=0.67uM，并可在類似水平上抑制SARS與MERS。
綜上所述，雖然SARS以來科學(xué)家在尋找抗冠狀病毒藥物上斷斷續(xù)續(xù)做了一些努力，目前尚無抗新型冠狀病毒的特效藥物，只能進(jìn)行支持治療，依賴患者自愈。但是新型冠狀病毒已經(jīng)形成全球蔓延趨勢(shì)，截止目前已經(jīng)在全球29個(gè)國(guó)家確診78000多例。目前COVID-19與MERS還沒有得到有效的控制，人們必須對(duì)其他冠狀病毒保持時(shí)刻警惕。此外，由于中間宿主不明確、新型冠狀病毒潛伏期長(zhǎng)，且存在無癥狀感染等原因，專家推測(cè)新型冠狀病毒很可能會(huì)跟流感一樣與人類長(zhǎng)期共存。特別希望引起注意的是，這次疫情在武漢地區(qū)集中爆發(fā)，我們擔(dān)心新型冠狀病毒可能已經(jīng)傳播到周圍的其他物種并作為傳染源潛伏下來。因此我們認(rèn)為開發(fā)針對(duì)3CLPro抑制劑的冠狀病毒治療藥物有非常重要的價(jià)值與意義。
▲1918年西班牙大流感三次爆發(fā)與死亡率（Ali Ekici）。流感第一波在1918年7月達(dá)到高峰，然后病死率下降到接近0。到10月，流感再次爆發(fā)，病亡率最高接近2.5%。次年2月，流感再次爆發(fā)，感染之前沒被感染過的人（Wilbur Chen）
特別感謝廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所提供N蛋白質(zhì)粒。感謝中科院上海巴斯德研究所錢志康教授、浙江大學(xué)黃耀偉教授、復(fù)旦大學(xué)黃強(qiáng)教授的指導(dǎo)與支持。感謝所有客戶的支持，讓我們有擔(dān)當(dāng)?shù)挠職馀c力量。
1. Alessandro Contini. Virtual screening of an FDA approved drugs database on tow COVID-19 coronavirus proteins.2. Arun K. Shanker, et.al. Analysis of Whole Genome Sequences and Homology Modelling of a 3C Like Peptidase.3. C M Chu, et.al. Role of lopinavir/ritonavir in the treatment of SARS: initial virological and clinical findings.4. Jared S. Morse, et.al. Learning from the Past: Possible Urgent Prevention and Treatment Options for Severe Acute Respiratory Infections Caused by 2019-nCoV.5. Ling-Ling Chen. Structural basis of SARS-CoV-2 3CLpro and anti-COVID-19 drug discovery from medicinal plants.6. Linlin Zhang, et.al. Alpha-ketoamides as broad-spectrum inhibitors of coronavirus and enterovirus Replication.7. Linlin Zhang, et.al. X-ray Structure of Main Protease of the Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Enables Design of α-Ketoamide Inhibitors.8. Samantha Zinnia Fernandes, et.al. Crystallization fo SARS Coronavirus 3CL protease to identify Inhibitor Targets.9. Si Chen, et.al. Feline Infectious Peritonitis Virus Nsp5 Inhibits Type I Interferon Production by Cleaving NEMO at Multiple Sites.10. Thanigaimalai Pillaiyar,et.al. Recent discovery and development of inhibitors targeting coronaviruses.11. Veena Nukoolkarn. et.al. Molecular dynamic simulations analysis of ritronavir and lopinavir as SARS-CoV 3CLpro inhibitors.12. Xin Liu, et.al. Potential inhibitorsfor2019-nCoV coronavirus M protease from clinically approved medicines.13. Zhijian Xu, et.al. Nelfinavir was predicted to be a potential inhibitor of 2019-nCov main protease by an integrative approach combining homology modelling, molecular docking and binding free energy calculation.
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